Stringer JM, Winship A, Zerafa N, Wakefield M, Hutt K. Oocytes can efficiently repair DNA double-strand breaks to restore genetic integrity and protect offspring health. Proc Natl Acad Sci U S A. 2020 May 26;117(21):11513-11522. doi: 10.1073/pnas.2001124117. Epub 2020 May 7. PMID: 32381741; PMCID: PMC7260990.
Чим цікаве це дослідження
Раніше вважалось, що “сплячі ” яйцеклітини (зупинені в розвитку), мають надзвичайно низьку толерантність до пошкодження ДНК, зокрема, дволанцюгових розривів). Навіть невелике пошкодження від хіміотерапії, опромінення чи просто старіння може призвести до їхньої швидкої загибелі (апоптозу), викликаючи раннє безпліддя. Це дослідження спростовує це, доводячи, що яйцеклітини здатні ремонтувати свою ДНК (вони активують необхідні для цього механізми, блокуючи апопотоз). Автори з’ясовують, як саме вони це роблять (які шляхи репарації використовують).
Тематика дослідження
Ооцити в примордіальних фолікулах ссавців підтримуються в унікальному стані зупинки росту та мейозу на стадії профази до років, перш ніж активуються для початку програми розвитку, що призводить до овуляції повністю зрілого ооцита, здатного підтримувати розвиток здорового потомства. Передчасне вичерпання запасу примордіальних фолікулів призводить до безпліддя та втрати ендокринної функції яєчників. Ці фізіологічні особливості роблять незрілі ооцити одними з найдовше живучих клітин у жіночому організмі, а отже — потенційно вразливими до пошкодження ДНК під впливом низки зовнішніх і внутрішніх стресорів.
Найнебезпечнішим типом пошкодження вважаються дволанцюгові розриви ДНК (DSB), оскільки вони сприяють хромосомним перебудовам і мутаціям, можуть викликати геномну нестабільність у разі неправильного відновлення або призводити до загибелі клітини, якщо репарація неможлива. DSB можуть мати місце в ооцитах, що перебувають у зупинці профази, після впливу іонізуючого випромінювання, хіміотерапевтичних препаратів чи токсикантів навколишнього середовища, або просто накопичуватись у таких ооцитах протягом тривалого життя внаслідок нормального метаболізму, оксидативного стресу та старіння. Безпосередньо перед профазною зупинкою ооцити проходять мейотичну рекомбінацію, зазнаючи сотень DSB, індукованих білком Spo11, які толеруються та згодом відновлюються шляхом гомологічної рекомбінації. Однак, на відміну від цього, ооцити з профазною зупинкою в примордіальних фолікулах мають надзвичайно низьку толерантність до ушкодження ДНК і швидко піддаються апоптозу під дією генотоксичних стресорів. Залишається незясованим, чи така чутливість зумовлена унікально низьким порогом активації апоптозу в цих ооцитах, чи їхньою нездатністю до ефективного безпомилкового відновлення ДНК, як припускалося раніше.
Результати дослідження мають важливі наслідки для жінок, які проходять лікування раку. Блокування апоптозу ооцитів для збереження майбутньої фертильності може бути ефективним лише за умови, що ооцити здатні відновлювати пошкодження. Це дослідження надає прямі докази такої здатності, підтримуючи стратегії збереження фертильності.
Мета дослідження
Автори досліджували здатність ооцитів з арештом у профазі до репарації дволанцюгових розривів, та роль репарації ДНК у визначенні кількості та якості ооцитів, доступних для підтримки жіночої репродукції. Зокрема мета включала: 1) аналіз відповіді ооцитів на пошкодження ДНК, індуковане γ-опроміненням, шляхом активації ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated, протеїнкіназа, яка відіграє критичну роль у відповіді клітини на пошкодження ДНК, зокрема дволанцюгові розриви), фосфорилювання гістону H2AX та локалізації RAD51, 2) визначення, які шляхи репарації ДНК (гомологічна рекомбінація (HR) чи негомологічне з’єднання кінців (NHEJ)) використовуються в ооцитах у профазному арешті, 3) дослідження, чи може репарація ДНК підтримувати фертильність та генетичну вірність у потомства, якщо апоптоз ооцитів пригнічений та вивчення ролі репарації ДНК як механізму контролю якості в жіночій статевій лінії.
Методи дослідження
Дослідження проводилось на мишах і включало низку експериментальних підходів:
Індукція пошкодження ДНК: Мишей (дикий тип та апоптоз-дефіцитні) піддавали повному γ-опроміненню різними дозами. Яєчники збирали через різні проміжки часу після опромінення. Тканини фіксували та готували для гістологічного аналізу або імунофлуоресцентного фарбування. Оцінювали маркери пошкодження та репарації ДНК (pATM, γH2AX, RAD51, DNA-PKcs) у ооцитах примордіальних та зростаючих фолікулів (імунофлуоресценція).
Дослідження фертильності: Дорослих самок спарювали з необробленими самцями протягом 6 місяців для оцінки фертильності.
Гістопатологія потомства: Проводили гістопатологічний аналіз 50 органів потомства опромінених самок.
Збір ооцитів та ембріонів: Використовували суперовуляцію для отримання ооцитів та природне спарювання для збору зигот і бластоцист. 20Ооцити/ембріони фіксували та фарбували для оцінки морфології та наявності γH2AX.
Повногеномне секвенування (WGS): ідентифікації мутацій у потомства.
Статистична обробка: дані представлені як середнє ± стандартна похибка (SEM). Використовували односторонній ANOVA (аналіз дисперсії) з подальшим тестом Тукі для множинних порівнянь (для параметричних даних), Крускала-Волліса для непараметричних даних, та t-тести для попарних порівнянь. Різниці вважалися статистично значущими при P<0.05.
Результати дослідження
- Ооцити в зупинці профази активують відповідь на пошкодження ДНК: pATM (фосфорильований ATM) та γH2AX (фосфорильований гістон H2AX) швидко локалізуються до ділянок пошкодження ДНК в ооцитах примордіальних фолікулів після γ-опромінення, що свідчить про активацію відповіді на пошкодження ДНК. Чутливість відповіді на пошкодження ДНК в примордіальних фолікулах, вірогідно, вища, ніж у зростаючих фолікулах та соматичних клітинах. Основний шлях репарації, що використовується ооцитами, — це гомологічна рекомбінація (HR), на що вказує локалізація RAD51 до ділянок пошкодження ДНК у >90% ооцитів.
- Апоптоз є домінуючим механізмом реакції на пошкодження ДНК у WT ооцитах: незважаючи на активацію репарації, навіть низькі дози γ-опромінення (0.1 Гр) призводять до значного виснаження примордіальних фолікулів у мишей дикого типу через апоптоз. Зростаючі фолікули та соматичні клітини при цьому залишаються переважно неушкодженими.
- Ооцити в профазному арешті можуть ефективно відновлювати DSB, якщо апоптоз пригнічений: у мишей, у яких апоптоз ооцитів блокований, примордіальні фолікули виживають після доз γ-опромінення (0.1 та 0.45 Гр), які є летальними для ооцитів дикого типу. У цих апоптоз-дефіцитних ооцитах спостерігалося зменшення кількості γH2AX фокусів, що свідчить про успішну репарацію ДНК. RAD51 також слідував подібній динаміці. Інгібування RAD51, сенсибілізувало апоптоз-дефіцитні ооцити до γ-опромінення, викликаючи їх виснаження, збільшення апоптозу та збереження невідновлених розривів, що підтверджує, що ооцити покладаються на механізм гомологічної репарації для відновлення пошкоджень DSB типу.
- Репарація ДНК достатня для відновлення функціональної фертильності та генетичної цілісності потомства: у апоптоз-дефіцитних мишей, які були опромінені, спостерігалася нормальна кількість овульованих ооцитів, зигот та бластоцист, а також нормальні показники вагітності та розміру посліду. Повногеномне секвенування потомства від опромінених апоптоз-дефіцитних самок не показало збільшення загальних показників мутацій порівняно з контролем, що свідчить про безпомилкову репарацію ДНК. Навіть спостерігався нижчий рівень мутацій у потомства від опромінених самок, ніж від неопромінених контрольних.
Висновки
- Ооцити, що перебувають у стані профазного арешту в примордіальних фолікулах, здатні ініціювати ефективну відповідь на пошкодження ДНК.
- Основний шлях репарації дволанцюгових розривів ДНК у цих ооцитах — це гомологічна рекомбінація.
- Хоча ооцити дикого типу швидко піддаються апоптозу навіть при низькому рівні пошкоджень ДНК, пригнічення апоптозу (як у TAp63−/− мишей) показує, що ооцити можуть ефективно відновлювати навіть серйозні пошкодження ДНК.
- Ефективна репарація ДНК достатня для підтримки функціональної фертильності та забезпечення здоров’я та генетичної цілісності потомства.
- Ці дані вказують на те, що репарація ДНК є важливим механізмом контролю якості в жіночій статевій лінії, який може функціонувати незалежно від апоптозу.
