Stringer JM, Winship A, Zerafa N, Wakefield M, Hutt K. Ооциты могут эффективно ремонтировать двухцепочечные разрывы ДНК для восстановления генетической целостности и защиты здоровья потомства . Proc Natl Acad Sci U S A. 2020 May 26;117(21):11513-11522. doi: 10.1073/pnas.2001124117. Epub 2020 May 7. PMID: 32381741; PMCID: PMC7260990.
Чем интересно это исследование
Ранее считалось, что «спящие» яйцеклетки (остановленные в развитии), имеют чрезвычайно низкую толерантность к повреждению ДНК, в частности, двухцепочечных разрывов). Даже небольшое повреждение от химиотерапии, облучения или просто старения может привести к их
Тематика исследования
Ооциты в примордиальных фолликулах млекопитающих поддерживаются в уникальном состоянии остановки роста и мейоза на стадии профазы до лет, прежде чем активируются для начала программы развития, что приводит к овуляции полностью зрелого ооцита, способного поддерживать развитие здорового потомства. Преждевременное исчерпание запаса примордиальных фолликулов приводит к бесплодию и потере эндокринной функции яичников. Эти физиологические особенности делают незрелые ооциты одними из самых долгоживущих клеток в женском организме, а следовательно — потенциально уязвимыми к повреждению ДНК под воздействием ряда внешних и внутренних стрессоров.
Самым опасным типом повреждения считаются двухцепочечные разрывы ДНК (DSB), поскольку они способствуют хромосомным перестройкам и мутациям, могут вызвать геномную нестабильность в случае неправильного восстановления или приводить к гибели клетки, если репарация невозможна. DSB могут иметь место в ооцитах, находящихся в остановке профазы, после воздействия ионизирующего излучения, химиотерапевтических препаратов или токсикантов окружающей среды, или просто накапливаться в таких ооцитах в течение длительной жизни в результате нормального метаболизма, оксидативного стресса и старения. Непосредственно перед профазной остановкой ооциты проходят мейотическую рекомбинацию, испытывая сотни DSB, индуцированных белком Spo11, которые теряются и впоследствии восстанавливаются путем гомологичной рекомбинации. Однако, в отличие от этого, ооциты с профазной остановкой в примордиальных фолликулах имеют чрезвычайно низкую толерантность к повреждению ДНК и быстро подвергаются апоптозу под действием генотоксических стрессоров. Остается неясным, обусловлена ли такая чувствительность уникально низким порогом активации апоптоза в этих ооцитах или их неспособностью к эффективному безошибочному восстановлению ДНК, как предполагалось ранее.
Результаты исследования имеют важные последствия для женщин, которые проходят лечение рака. Блокирование апоптоза ооцитов для сохранения будущей фертильности может быть эффективным только при условии, что ооциты способны восстанавливать повреждения. Это исследование предоставляет прямые доказательства такой способности, поддерживая стратегии сохранения фертильности.
Цель исследования
Авторы исследовали способность ооцитов с арестом в профазе к репарации двухцепочечных разрывов, и роль репарации ДНК в определении количества и качества ооцитов, доступных для поддержки женской репродукции. В частности цель включала: 1) анализ ответа ооцитов на повреждение ДНК, индуцированное γ-облучением, путем активации ATM (AtaxiaTelangiectasia Mutated, протеинкиназа, которая играет критическую роль в ответе клетки на повреждение ДНК, в частности двухцепочечные разрывы), фосфорилирования гистона H2AX и локализации RAD51, 2) определение, какие пути репарации ДНК (гомологическая рекомбинация (HR) или негомологичное соединение концов (NHEJ)) используются в ооцитах в профазном аресте, 3) исследование, может ли репарация ДНК поддерживать фертильность и генетическую верность у потомства, если апоптоз ооцитов подавлен и изучение роли репарации ДНК как механизма контроля качества в женской половой линии.
Методы исследования
Исследование проводилось на мышах и включало ряд экспериментальных подходов:
Индукция повреждения ДНК: Мышей (дикий тип и апоптоз-дефицитные) подвергали полному γ-облучению различными дозами. Яичники собирали через разные промежутки времени после облучения. Ткани фиксировали и готовили для гистологического анализа или иммунофлуоресцентного окрашивания. Оценивали маркеры повреждения и репарации ДНК (pATM, γH2AX, RAD51, DNA-PKcs) в ооцитах примордиальных и растущих фолликулов (иммунофлуоресценция).
Исследование фертильности: Взрослых самок спаривали с необработанными самцами в течение 6 месяцев для оценки фертильности.
Гистопатология потомства: Проводили гистопатологический анализ 50 органов потомства облученных самок.
Сбор ооцитов и эмбрионов: Использовали суперовуляцию для получения ооцитов и естественное спаривание для сбора зигот и бластоцист. 20Ооциты/эмбрионыфиксировали и окрашивали для оценки морфологии и наличия γH2AX.
Полногеномное секвенирование (WGS): идентификации мутаций у потомства.
Статистическая обработка: данные представлены как среднее ± стандартная погрешность (SEM). Использовали односторонний ANOVA (анализ дисперсии) с последующим тестом Туки для множественных сравнений (для параметрических данных), Крускала-Воллиса для непараметрических данных, и t-тесты для попарных сравнений. Разницы считались статистически значимыми при P<0.05.
Результаты исследования
- Ооциты в остановке профазы активируют ответ на повреждение ДНК: pATM (фосфорилированный ATM) и γH2AX (фосфорилированный гистон H2AX) быстро локализуются к участкам повреждения ДНК в ооцитах примордиальных фолликулов после γ-облучения, что свидетельствует об активации ответа на повреждение ДНК. Чувствительность ответа на повреждение ДНК в примордиальных фолликулах, вероятно, выше, чем в растущих фолликулах и соматических клетках. Основной путь репарации, используемый ооцитами, — это гомологическая рекомбинация (HR), на что указывает локализация RAD51 к участкам повреждения ДНК в >90% ооцитов.
- Апоптоз является доминирующим механизмом реакции на повреждение ДНК в WT ооцитах: несмотря на активацию репарации, даже низкие дозы γ-облучения (0.1 Гр) приводят к значительному истощению примордиальных фолликулов у мышей дикого типа из-за апоптоза. Растущие фолликулы и соматические клетки при этом остаются преимущественно неповрежденными.
- Ооциты в профазном аресте могут эффективно восстанавливать DSB, если апоптоз подавлен: у мышей, у которых апоптоз ооцитов блокирован, примордиальные фолликулы выживают после доз γ-облучения (0.1 и 0.45 Гр), которые являются летальными для ооцитов дикого типа. В этих апоптоз-дефицитных ооцитах наблюдалось уменьшение количества γH2AX фокусов, что свидетельствует об успешной репарации ДНК. RAD51 также следовал подобной динамике. Ингибирование RAD51, сенсибилизировало апоптоз-дефицитные ооциты к γ-облучению, вызывая их истощение, увеличение апоптоза и сохранение невосстановленных разрывов, что подтверждает, что ооциты полагаются на механизм гомологичной репарации для восстановления повреждений DSB типа.
- Репарация ДНК достаточна для восстановления функциональной фертильности и генетической целостности потомства: у облученных апоптоз-дефицитных мышей наблюдалось нормальное количество овулированных ооцитов, зигот и бластоцист, а также нормальные показатели беременности и размера последа. Полногеномное секвенирование потомства от облученных апоптоз-дефицитных самок не показало увеличения общих показателей мутаций по сравнению с контролем, что свидетельствует о безошибочной репарации ДНК. Даже наблюдался более низкий уровень мутаций у потомства от облученных самок, чем от необлученных контрольных.
Выводы
- Ооциты, находящиеся в состоянии профазного ареста в примордиальных фолликулах, способны инициировать эффективный ответ на повреждение ДНК.
- Основной путь репарации двухцепочечных разрывов ДНК в этих ооцитах — это гомологическая рекомбинация.
- Хотя ооциты дикого типа быстро подвергаются апоптозу даже при низком уровне повреждений ДНК, подавление апоптоза (как у TAp63-/- мышей) показывает, что ооциты могут эффективно восстанавливать даже серьезные повреждения ДНК.
- Эффективная репарация ДНК достаточна для поддержания функциональной фертильности и обеспечения здоровья и генетической целостности потомства.
- Эти данные указывают на то, что репарация ДНК является важным механизмом контроля качества в женской половой линии, который может функционировать независимо от апоптоза.
